Con la contribución de un consorcio de empresas dirigido por WFSR (Wageningen Food Safety Research, Países Bajos), Randox Food Diagnostics ha desarrollado un ELISA lo suficientemente sensible como para medir los alcaloides del cornezuelo en torno al valor límite. El ELISA ha sido validado para centeno, cebada, trigo, avena y espelta, y no se encontraron falsos negativos en las muestras de campo analizadas.
Los procesadores de cereales se enfrentan regularmente a la presencia de alcaloides tóxicos del cornezuelo de centeno (AE). Europa ha establecido nuevos límites de detección desde principios de 2022, pero los análisis son caros y requieren mucho tiempo. Por ello, el sector necesita un método más rápido y barato que permita identificar antes los lotes infectados. Gracias al éxito de un proyecto del Top Consortium for Knowledge and Innovation (TKI, Países Bajos), dirigido por el WFSR, este método ya está disponible.
Legislación
Desdeel 1 de enero de 2022, se han establecido nuevas normas en el Reglamento Europeo UE 2021/1399 tanto para la presencia de esclerocios en cereales como de toxinas en los cereales o productos derivados de ellos. La Tabla 1 ofrece una visión general de los límites, detallando los 12 EAs que se regulan. EU 2021/1399 distingue entre la presencia de esclerocios y EAs, pero también entre los diferentes granos e incluso los diferentes productos derivados de los cereales.
Además, la Comisión Europea (CE) espera que el contenido de EA en la harina siga disminuyendo debido a las mejoras en los procesos. La CE ya se está anticipando a ello introduciendo normas más bajas en 2024, pero no es inconcebible que la CE rebaje aún más los límites en el futuro. El límite más bajo se aplica a la alimentación infantil, ya que los niños y las mujeres embarazadas parecen ser los más sensibles, y los niños tienen de media un mayor consumo de cereales por kg de peso corporal.
El Reglamento (UE) 2021/1399 tiene consecuencias para el control de los EA y la gestión de los lotes de cereales contaminados por parte de las empresas. Un ejemplo: un productor de nutrición infantil no debe utilizar un lote de trigo con un contenido de EA superior a 20 µg/kg para el desayuno integral Brinta (límite de 20 µg/kg), pero tal vez pueda seguir utilizándolo para harina autolevadura (límite de 100 µg/kg).
Cuadro 1
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Nuevo método para los alcaloides del cornezuelo del centeno
Es crucial que las empresas controlen el nivel de EAs. Una de las formas de evitar que niveles elevados de EAs acaben en el producto final, es utilizar una prueba rápida en el lugar donde se almacenan o procesan los cereales o un control rápido de los productos listos para el consumo. Hasta ahora, los EA sólo podían medirse con LC-MS/MS o HPLC-FLD. Estos métodos son precisos, pero también largos y caros.
En 2019, TKI Agri&Food financió un proyecto (LWV19252) que tenía como objetivo contribuir al desarrollo de una prueba ELISA validada para EA en colaboración con socios de la industria. El acceso a muestras prácticas, especialmente muestras en blanco con el nivel más bajo posible de EA, fue esencial para la creación de un ELISA validado. El Comité de Comerciantes de Cereales suministró las diversas muestras de cereales utilizadas por WFSR y Eurofins para la elaboración de materiales de control de calidad. Randox Food Diagnostics utilizó los materiales de control de calidad para la primera validación del ELISA que habían desarrollado. En unasegunda ronda en la que se utilizaron muestras de campo, la prueba ELISA fue validada por Randox Food Diagnostics, WFSR y Nutrilab como tercera parte independiente.
La colaboración dio como resultado una prueba ELISA útil para detectar alcaloides del cornezuelo del centeno, la cebada, el trigo, la avena y la espelta.
Diseño de la investigación
El proyecto se dividió en 2 fases. En la fase 1 (2021, Figura 1), los comerciantes de grano suministraron un total de 70 muestras de 5 granos diferentes. Estas muestras se higienizaron eliminando manualmente todos los esclerocios presentes. A continuación, los cereales se molieron hasta obtener un polvo. Se añadieron EA hasta las concentraciones límite máximas permitidas de acuerdo con EU 2021/1399. Los niveles de EA se midieron con un método LC-MS/MS validado y estos datos se utilizaron para la primera validación del ELISA recién desarrollado. En la fase 2 (2022) se entregaron nuevas muestras de grano. Estas muestras se molieron sin limpiar y se dividieron en tres porciones. Se analizaron alícuotas independientemente para detectar la presencia de EAs. En esta fase, el ELISA fue realizado por el desarrollador del kit (Randox Food Diagnostics) y por un laboratorio independiente (Nutrilab).
Figura 1
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Resultados
La figura 2 muestra los resultados de la fase 1. Los cuadrados representan el contenido de EA de los blancos limpiados medido por el método LC-MS/MS y el ELISA. El ELISA da un fondo ligeramente más alto que el LC-MS/MS. Los puntos representan los resultados de las muestras de grano enriquecidas con los 12 EA diferentes en cantidades iguales hasta un total de 250 µg/kg para el centeno o 150 µg/kg para los otros cuatro granos. En general, los resultados de LC-MS/MS y ELISA coinciden bien. No hay falsos negativos, lo que significa que el ELISA puede desempeñar un papel valioso en el control de la seguridad alimentaria de los cereales. El ELISA da un nivel superior a 50 µg/kg para cuatro muestras en blanco, aparentemente un resultado falso positivo. Pero esto hay que verlo en su contexto.
Figura 2
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En la fase 2, se midieron muestras auténticas, como puede verse en la figura 3. En todos los cereales se encontraron algunas muestras con un contenido de EA superior al límite legal, tanto por LC-MS/MS como por ELISA (véanse, por ejemplo, las muestras de trigo 3, 7 y 14 en la figura siguiente). Esto ilustra una vez más el valor del ELISA, porque sobre la base de un resultado positivo, el comerciante de grano puede, por ejemplo, decidir elegir una aplicación diferente para el lote de grano. Sorprendentemente, en algunas muestras (trigo 13, 16) el ELISA da un nivel significativamente más alto de EAs que el LC-MS/MS. En contraste con ELISA, LC-MS/MS ve todos los EAs individuales: así que además de los 12 EAs regulados, también EAs que pueden estar presentes en el grano, pero que todavía no están regulados. El ELISA no puede hacer esa distinción y, por tanto, mide la suma de EAs reguladas y no reguladas. Llama la atención, y esto se puede ver claramente en las muestras 8, 9 y 10 de cebada, que el ELISA parece reaccionar más fuertemente a la presencia de EA no regulados. Ejemplos de ello son los EA de tipo clavina. Por lo tanto, la prueba ELISA puede dar más fácilmente un falso resultado positivo en el caso de granos que contengan EA no regulados. En caso de un resultado positivo de ELISA, el comerciante de cereales puede considerar la realización de un análisis químico adicional, que puede llevar a la conclusión de que el grano cumple los requisitos legales. Además, es importante que las muestras de grano se muelan adecuadamente y lo más fino posible, para obtener un resultado representativo. Los esclerocios son difíciles de moler y distribuir homogéneamente por toda la muestra de ensayo.
Figura 3
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Resumen y conclusiones
Desde el 1 de enero de 2022 están en vigor límites europeos para la presencia de EA en los productos a base de cereales.
LC-MS/MS es el método más común para medir cuantitativamente los EAs. Este método es preciso, pero también lento y caro. La industria necesita un método más rápido y barato, para poder identificar antes los lotes contaminados.
Con la contribución de un consorcio de empresas liderado por el WFSR, Randox Food Diagnostics ha desarrollado un ELISA lo suficientemente sensible como para medir la EA en torno al valor límite. El ELISA ha sido validado para centeno, cebada, trigo, avena y espelta, y no se encontraron falsos negativos en las muestras de campo analizadas.
El ELISA sólo requiere una sencilla preparación de la muestra sin necesidad de limpieza adicional de la misma.
El ELISA parece ser sensible a algunos EA que no están regulados, como los EA de tipo clavina. Estos EA suelen presentarse en concentraciones más bajas que los doce regulados pero, no obstante, pueden dar lugar a muestras falsamente sospechosas.
Agradecimiento
La investigación se llevó a cabo en el marco del proyecto LWV19252, iniciativa holandesa para la evaluación y garantía de calidad de métodos rápidos en pruebas de seguridad alimentaria, financiado por TKI Agri&Food. Los socios participantes fueron: El Comité de Comerciantes de Cereales, Nutrilab BV, Eurofins Labco, Randox Food Diagnostics y Wageningen Food Safety Research. Lea el artículo completo aquí.