La producción de gas es una prueba in vitro habitual en muchos centros de investigación y laboratorios comerciales, ya que es barata, rápida y fácil de reproducir con sistemas manuales o automatizados. Sin embargo, la recogida de líquido ruminal requiere animales canulados o intubados con tubos esofágicos. Los animales canulados en el rumen suelen requerir procedimientos complejos para obtener permisos oficiales y pueden tener costes de mantenimiento elevados, mientras que la aspiración de líquido ruminal a través de una sonda esofágica requiere la inmovilización de los animales y no es adecuada para el muestreo rutinario.

Opciones de recogida de líquido ruminal

Una alternativa es recoger el líquido ruminal inmediatamente después del sacrificio, pero no siempre se conoce la composición de los alimentos suministrados a los animales y se requiere el acceso a un matadero situado cerca del laboratorio. Almacenar el líquido ruminal manteniendo la viabilidad de la actividad microbiana permitiría utilizar el mismo inóculo para varias ejecuciones in vitro dentro de un laboratorio, con probables ventajas de reproducibilidad

Como alternativa, sería posible concentrar la recogida de líquido ruminal en centros especializados y transferir el inóculo a laboratorios cercanos. Además, la reducción del volumen mediante la separación de una fracción que contenga la mayor parte de las bacterias del líquido ruminal facilitaría el almacenamiento y el transporte. Desgraciadamente, los esfuerzos de investigación destinados a conservar el líquido ruminal durante largos periodos de tiempo mediante la congelación o la liofilización no han dado resultados satisfactorios en cuanto al mantenimiento de las características originales de la fermentación. Sin embargo, se ha demostrado que la refrigeración es adecuada para almacenar el líquido ruminal hasta 48 horas

Objetivo del estudio: transferencia y almacenamiento

Nuestro objetivo general era estudiar un procedimiento para manipular el inóculo ruminal con el fin de facilitar su almacenamiento y traslado entre laboratorios antes de utilizarlo como inóculo para la técnica de producción de gas. Los objetivos específicos eran ensayar fluidos ruminales refrigerados en un periodo de almacenamiento progresivo de 24 horas; y gránulos ruminales, obtenidos por centrifugación de los fluidos ruminales frescos, que se refrigeran y luego se reconstituyen

Experimentos in vitro

The study comprised 2 in vitro rumen fermentation experiments with gas production measured from graduated 100mℓ glass syringes. Rumen fluid was collected at a slaughterhouse from culled dairy cows which had previously been fed under controlled conditions. The inoculum was delivered to our laboratory within 30 minutes from slaughter in airtight glass bottles refluxed with carbon dioxide and maintained at 39°C.

• En el experimento 1: se recogió un total de aproximadamente 5ℓ de líquido ruminal de cuatro vacas, se mezcló y luego se dividió en 5 alícuotas iguales. La primera fracción se utilizó inmediatamente para la producción de gas, mientras que las otras 4 fracciones se almacenaron en un refrigerador a 4°C en botellas cerradas y enjuagadas con CO2. Las alícuotas se almacenaron durante 24, 48, 72 y 96 horas y luego se calentaron a 39°C, se tomaron muestras para el análisis del pH, el amoníaco y los ácidos grasos volátiles (AGV), y se utilizaron como inóculo para las fermentaciones de producción de gas. El experimento se repitió 3 veces.
• En el experimento 2: se recogieron fluidos ruminales de 3 vacas (1ℓ por vaca) y se dividieron en 2 alícuotas iguales. La primera alícuota de cada vaca se utilizó inmediatamente para la producción de gas. Las otras se pesaron y se centrifugaron a 13.000×g durante 30 minutos a 4°C. Se descargó el sobrenadante, se pesó el pellet residual para calcular el rendimiento del pellet y se refrigeró a 4°C. Después de 48 horas, los 3 pellets se reconstituyeron hasta alcanzar un volumen igual al de los fluidos ruminales originales utilizando tampón McDougall caliente (39°C), con 5g/ℓ de maltosa añadida, y se utilizaron como inóculo de fermentación. El experimento se repitió dos veces.

En ambos experimentos, las evaluaciones in vitro se realizaron con harina de maíz, harina de soja, harina de trigo, harina de alfalfa deshidratada y una ración mixta total (TMR). Las muestras de la TMR se secaron a 60°C durante 48 horas y todas las muestras de alimento se molieron a través de un tamiz de 1mm. Se pesaron aproximadamente 220mg de cada muestra seca en 3 jeringas de vidrio graduadas de 100mℓ, que se llenaron con 30mℓ de líquido ruminal diluido. Las jeringas se colocaron verticalmente en un baño de agua a 39°C, con 3 jeringas sin sustrato como espacios en blanco

Medición de la producción de gas

La producción de gas se midió a las 24 horas en el experimento 1 y a las 0, 1, 2, 4, 6, 8, 24 y 48 horas después de la incubación en el experimento 2. Las jeringas se agitaron manualmente cada 2 a 8 horas de incubación, y luego a las 24 horas. En ambos experimentos, se comparó la producción de gas de diferentes alícuotas del mismo fluido ruminal en sesiones de incubación posteriores (por ejemplo, fresco, refrigerado a las 24 horas, refrigerado a las 48 horas, etc.). Para tener en cuenta el efecto de la sesión de incubación, se incluyó fluido ruminal estándar en cada sesión de incubación dentro de cada corrida de fermentación

Resultados del estudio

La fermentación del líquido ruminal estándar dio rendimientos de gas similares entre las sesiones de incubación en ambos experimentos (variaciones inferiores al 5% no mostradas) y, por tanto, los datos no se corrigieron.

• Experimento 1 – Refrigeración del fluido ruminal hasta 96 horas: La refrigeración no modificó el rendimiento total de AGV, las proporciones de AGV y el pH, pero aumentó (P<0,05) el nivel de amoníaco en los fluidos ruminales refrigerados durante 48, 72 y 96 horas en comparación con los frescos (36,6 a 44,7 frente a 23,4mg/dℓ). Los rendimientos de gas del fluido ruminal refrigerado durante 72 horas no difirieron del inóculo fresco, pero hubo una disminución (P<0,01) cuando se utilizó el fluido ruminal después de 96 horas de refrigeración.
• Experimento 2 – Refrigeración de los sólidos del fluido ruminal durante 48 horas: Los 6 fluidos ruminales tenían diferentes características físico-químicas (pH 6,1 + 0,4; amoníaco 22,9 + 13,7 mg/dℓ L; AGV totales 111,7 + 13,1 mmol/ℓ) y el rendimiento de pellets fue de 151 + 42 g/kg del peso inicial del fluido ruminal. Hubo una interacción entre inóculo×sustrato de alimentación (P <0,01) para la tasa de producción de gas, pero el impacto de la interacción al cuadrado medio del modelo fue mucho menor que el de los efectos principales correspondientes. Por lo tanto, sólo se muestran y discuten los resultados de los efectos principales del modelo. El rendimiento máximo de gas (asíntota) fue mayor con el inóculo fresco en comparación con el obtenido con el pellet (286 frente a 263 mℓ/g MS; P<0,01), mientras que la tasa de degradación mostró el patrón opuesto (0,072 y 0,093mℓ/h para el inóculo fresco y el pellet, respectivamente; P<0,01). Además, el líquido reconstituido tuvo una fase de retardo más larga en comparación con el fresco (0,70 frente a 0,14 horas; P<0,01). La producción de gas a las 24 horas fue similar para el inóculo fresco y el pellet; en la regresión lineal entre el gas medido a las 24 horas de fermentación del inóculo fresco y del pellet (ajustado por el efecto del líquido ruminal) se muestra (R2 = 0,94).

Respuesta al choque de frío

La concentración de metabolitos de fermentación en el líquido ruminal no se modificó con la refrigeración, aparte de un aumento de la concentración de amoníaco. La respuesta de choque al frío es una reacción compleja mediante la cual los grupos bacterianos se adaptan a las temperaturas frías. Esto incluye varios procesos metabólicos, como la modificación de los lípidos de la membrana y la síntesis de proteínas capaces de favorecer el metabolismo de los azúcares. Es probable que el aumento de los niveles de amoníaco tras la refrigeración se deba al incremento del metabolismo de las proteínas debido al frío. Se sugiere que una fase de refrigeración podría mejorar la viabilidad posterior de las células debido al efecto protector del choque de frío que producen las proteínas. De ser así, una implicación práctica en el campo de la conservación del inóculo ruminal podría ser la investigación de protocolos óptimos de preenfriamiento antes de la refrigeración completa.

Enfriamiento del líquido ruminal hasta 96 horas

A pesar de la similitud de los metabolitos fermentativos con 96 horas de refrigeración, hubo una disminución en la producción de gas de 24 horas a 96 horas de refrigeración. Sin embargo, estos resultados no eran inesperados si nos basamos en Robinson et al. (1999), que encontraron una degradabilidad estable de la FDN en el líquido ruminal fresco y refrigerado durante 48 horas (4°C). Otro estudio informó de que la refrigeración del inóculo durante 6 horas no afectó a la producción de gas in vitro, pero 24 horas de refrigeración redujeron la tasa de fermentación. Además, en otros 2 estudios se mantuvo la fermentabilidad ruminal del fluido ruminal fresco, medida en términos de producción de gas, cuando se conservó durante aproximadamente 4 horas a 4-6°C

Enfriamiento de los sólidos del líquido ruminal durante 48 horas

La centrifugación se utiliza ampliamente para separar los microbios del rumen de los líquidos y las partículas del alimento en el fluido del rumen. Desafortunadamente, los protocolos de centrifugación (por ejemplo, la fuerza centrífuga, el tiempo y la temperatura) no están estandarizados. Sin embargo, en estudios bien conocidos los investigadores probaron 3 velocidades de centrifugación (5, 10 y 26×103 x g y 5, 17 y 30×103 x g, respectivamente) durante 20 o 30 minutos. Como ambos grupos no informaron de diferencias en la cantidad de bacterias ruminales separadas por las diferentes velocidades de centrifugación, utilizamos un valor intermedio de 13×103×g. Un estudio anterior también utilizó esta velocidad de centrifugación en la preparación de un pellet ruminal para estudiar la recuperación de glucógeno de los microbios del rumen al comparar los métodos de aislamiento de las bacterias del rumen. En nuestro estudio, el rendimiento del pellet húmedo fue variable (es decir, 151 + 42g/kg del volumen inicial de líquido ruminal), lo que probablemente refleja diferencias en la densidad de las partículas del líquido ruminal recogido, a pesar de utilizar un procedimiento de filtración común. Las variaciones en el rendimiento del pellet se reflejarán en el fluido ruminal reconstituido, lo que requiere el uso de espacios en blanco (es decir, la fermentación a partir de botellas que sólo contienen fluido de fermentación).

Conclusiones

Nuestros resultados muestran que el fluido ruminal conservado por refrigeración (a 4°C hasta 72 horas) o reconstituido a partir de un pellet bacteriano refrigerado (a 4°C durante 48 horas), no deprime la producción de gas en 24 horas. El fluido ruminal refrigerado (o el pellet) es una alternativa al fluido fresco y facilitaría el suministro y el transporte de fluido ruminal entre laboratorios, así como el uso potencial del mismo inóculo en repetidas fermentaciones dentro del laboratorio. Esto reduciría la necesidad de que los laboratorios mantuvieran donantes animales y/o redujeran la frecuencia de recogida de líquido ruminal.