Una cepa natural de Bacillus subtilis DSM 32315 que forma esporas ha demostrado ser segura para la aplicación comercial en aves de corral, estable en el proceso de fabricación de piensos comerciales y en condiciones de granulación y estable en condiciones de almacenamiento adversas sin pérdida de esporas.
El Bacillus subtilis (B. subtilis) es una bacteria Gram-positiva con forma de vara, que se encuentra comúnmente en el suelo y en el tracto gastrointestinal normal de los seres humanos y los animales. Es un anaerobio facultativo e históricamente se ha considerado como un aerobio obligatorio. Al igual que otros miembros del género Bacillus, se prefiere utilizarlo como probiótico o como microbiano de alimentación directa en la alimentación de las aves de corral debido a su capacidad para formar endosporas y sobrevivir a la temperatura y la presión de la granulación. Cada cepa de B. subtilis tiene características únicas que pueden determinar su función y eficacia.
Por lo tanto, la información relativa a una cepa en particular no puede generalizarse a todas las B. Subtilis. Desde un punto de vista práctico, la eficacia de un probiótico puede verse limitada por factores que pueden afectar a su aplicación en condiciones comerciales.
El Bacillus subtilis DSM 32315 es una cepa de probiótico seleccionada de entre cientos de aislamientos de Bacillus spp. que se producen de forma natural. Su proceso de selección se basó en un estricto proceso de pasos multiparámetro. Estos procesos incluían la evaluación de la seguridad, la estabilidad térmica y la viabilidad en el tracto digestivo de los pollos. Aquí, el enfoque está en dos de estos procesos multi-parámetros: (1) Evaluación de seguridad y (2) estabilidad térmica.
Evaluación de la seguridad
Aunque en general se reconoce que los microorganismos utilizados como probióticos en los piensos son seguros, todavía pueden existir ciertos riesgos asociados a algunas cepas de probióticos. Entre ellos figuran la presencia de genes de resistencia a los antibióticos transmisibles, la presencia de plásmidos o elementos genéticos móviles que son transferibles entre la población bacteriana presente en un medio ambiente, y la presencia de genes de toxinas, por ejemplo, enterotoxinas. Por consiguiente, es importante evaluar, a nivel de la cepa, la inocuidad del microorganismo considerado para su uso como probiótico en la alimentación animal.
B. subtilis DSM 32315 se evaluó para los genes relacionados con la toxina utilizando los genes de referencia de B. cereus (EFSA Journal, 2014) y se demostró que no contenía ningún gen de enterotoxina hemolítica (nheABC), hemo-lisina (hblCDAB), citotoxina (cytK) o cereulida (cesA). Además, se evaluó B. subtilis DSM 32315 para determinar la presencia o ausencia de plásmidos, así como de genes de resistencia a los antibióticos, basándose en la comparación realizada con la Base de Datos Integral de Resistencia a los Antibióticos (CARD). No se identificaron secuencias de plásmidos ni genes relevantes de resistencia a los antibióticos, lo cual fue validado por ensayos MIC (EFSA Journal 2012). Basándose en esta información, se determinó que B. subtilis DSM 32315 es seguro para ser utilizado como probiótico en la alimentación animal.
Estabilidad del calor en el procesamiento de alimentos
La granulación de piensos es un proceso mecánico que garantiza que las pequeñas partículas de los ingredientes de los piensos se aglomeren en partículas más grandes mediante la aplicación de humedad, calor y presión. Se ha reconocido que el peletizado de los alimentos para aves de corral mejora la ingesta de alimentos, el aumento de peso y la eficiencia alimentaria. Esto puede atribuirse a la mejora de la palatabilidad del alimento, la uniformidad de los nutrientes y las alteraciones en los ingredientes, como la modificación del almidón y las proteínas. Sin embargo, el proceso de peletización puede ser perjudicial para ciertos ingredientes de los piensos, lo que repercute en la disponibilidad de nutrientes para el crecimiento.
Los microbianos de alimentación directa son una clase de aditivos para piensos que pueden verse afectados por el proceso de peletización. Por ejemplo, los DFM que no forman esporas, como las especies de Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus y Pediococcus, muestran una estabilidad térmica relativamente baja en comparación con el probiótico Bacillus sp. que forma esporas. Es importante que un probiótico permanezca estable durante todo el proceso de elaboración, transporte y almacenamiento del alimento, de modo que cuando se alimente a los animales pueda ejercer su actividad. Por lo tanto, se realizaron dos ensayos para demostrar la estabilidad de las esporas de B. subtilis DSM 32315 en el procesamiento de alimentos comerciales y en las condiciones de almacenamiento.
Tasa de supervivencia de B. subtilis DSM 32315
El objetivo del primer ensayo era evaluar la capacidad de supervivencia y la tasa de supervivencia de B. subtilis DSM 32315 en un proceso de fabricación de piensos comerciales. Las esporas de Bacillus subtilis DSM 32315 se mezclaron en el alimento inicial para pollos formulado para obtener una concentración final esperada en el alimento de 1×106 UFC/g de alimento. A fin de comprobar la supervivencia de las esporas mediante la granulación del alimento, se contó el total de esporas a partir de 10 muestras de alimento en forma de papilla obtenidas inmediatamente después de la mezcla y luego de otras 10 muestras obtenidas después de que el alimento en forma de papilla se hubiera acondicionado durante 6 minutos y se hubiera sometido a diferentes temperaturas de granulación: 186 °F (85,5 °C), 190 °F (87,7 °C) y 195 °F (90,5 °C), (4 grupos de prueba; 10 muestras/cada grupo de prueba = total de 40 muestras).
Todas las muestras fueron analizadas para el recuento de esporas viables usando un método de cultivo en serie de placas de dilución. Los recuentos de esporas se reportaron como la transformación Log10 de unidades formadoras de colonias por gramo de alimento (Log10 CFU/g de alimento). Los resultados se analizaron estadísticamente en el JMP v13.1.0 (SAS Institute Inc.), y la significación estadística se determinó en P ≤ 0.05. No hubo diferencias significativas (P = 0,761) en esporas viables de B. subtilis entre el alimento en forma de papilla y todos los alimentos peletizados obtenidos de la misma fuente (Figura 1a). La recuperación de las esporas viables estuvo a los niveles esperados en todo el alimento peletizado en comparación con el alimento de mezcla de control (Figura 1b). Este resultado indica que B. subtilis DSM 32315 puede sobrevivir un largo tiempo de acondicionamiento y una alta temperatura de peletización. Una alta tasa de supervivencia durante el procesamiento comercial de los alimentos asegura que un número adecuado de esporas viables esté presente en el alimento terminado, proporcionando así los beneficios deseados.
La enumeración de esporas del DSM 32315 de B. subtilis no muestra ninguna pérdida de esporas en el alimento de la misma fuente antes y después de la granulación a diferentes temperaturas.
Figura 1b – El porcentaje de recuperación de esporas del alimento a diferentes temperaturas de peletización en comparación con el alimento de control muestra que las esporas de B. subtilis DSM 32315 son estables a altas temperaturas de peletización.
Capacidad de B. subtilis DSM 32315 para seguir siendo viable
El objetivo del segundo ensayo era evaluar la capacidad de las esporas de B. subtilis DSM 32315 para seguir siendo viables en condiciones de almacenamiento adversas. Para este ensayo, las esporas de B. subtilis DSM 32315 se mezclaron en el alimento para pollos para obtener una concentración final prevista en el alimento de 1×106 UFC/g de alimento. El alimento para pollos se peleó por primera vez a 85°C (185°F). La viabilidad de las esporas se evaluó en 3 muestras de alimento replicado directamente después de la granulación y nuevamente después de 2, 4, 8 y 12 semanas de almacenamiento a 40°C (104°F) y 80 % de humedad. Los resultados obtenidos de este ensayo mostraron que no había diferencias significativas (P = 0,286) en las esporas viables de B. subtilis DSM 32315 a las 0, 2, 4, 8, o 12 semanas de almacenamiento (Figura 2).
Figura 2 – La numeración de esporas de B. subtilis DSM 32315 en el alimento no muestra ninguna pérdida de esporas tras el almacenamiento del alimento en condiciones adversas durante varias semanas.
Referencias disponibles a petición
Por Bayo Sokale y Anita Menconi, Gerentes de Servicios Técnicos, Evonik Industries
