Están surgiendo tecnologías prometedoras y emocionantes para ayudar en la lucha contra las micotoxinas. Uno de estos avances es el silenciamiento de genes inducido por el huésped. La investigación ha demostrado cómo se puede utilizar para aliviar la aflatoxina en el maíz durante la pre-cosecha.
Los esfuerzos por aliviar la aflatoxina de los alimentos/piensos han adoptado durante decenios un enfoque de investigación múltiple, tanto de la comunidad comercial como de la académica. Los esfuerzos incluyen el uso de cepas de Aspergillus que no producen toxinas para superar a las cepas productoras de toxinas que se producen naturalmente, el cultivo de resistencia a hongos o toxinas en cultivos susceptibles y el uso de agentes quelantes para aglutinar la toxina y hacer que ya no esté disponible biológicamente. A pesar de estos esfuerzos combinados, se estima actualmente que cada año se pierden millones de toneladas de diversos cultivos, entre los que el maíz es el principal, debido a que los cultivos cosechados contienen límites de aflatoxina superiores a los reglamentarios.
Alivio de la aflatoxina en el maíz
El maíz es ampliamente consumido en todo el mundo y es muy susceptible a la contaminación por aflatoxinas; según las estimaciones actuales, casi 5.000 millones de personas, predominantemente en los países en desarrollo, están expuestas crónicamente a la aflatoxina por el consumo de cultivos contaminados. Sin embargo, se ha utilizado con éxito una estrategia de biotecnología de supresión del ARNi para aliviar la aflatoxina en los granos de maíz en desarrollo. Este novedoso enfoque aprovecha dos descubrimientos científicos recientes: uno, que todas las células eucarióticas contienen un mecanismo de supresión de genes en el que interviene una proteína llamada dicer y que esta proteína utiliza una molécula patrón consistente en un pequeño ARN de interferencia (siRNA); y dos, que estas moléculas de siRNA son capaces de pasar entre una planta huésped y su patógeno contaminante. Cuando un organismo introduce y expresa moléculas de siARN con una secuencia específica, inicia la degradación de los transcritos endógenos que contienen secuencias homólogas a la molécula de siARN introducida. El resultado final es el silenciamiento o la supresión de un gen específico dentro de un organismo mediante la introducción de una molécula de siARN diseñada. Si la transcripción de ARN de un gen se suprime de esta manera, la transcripción no está disponible para ser traducida a una proteína, y con la proteína ausente no es capaz de realizar su actividad enzimática, y a su vez, en este ejemplo, la enzima objetivo es parte de una vía de toxinas biosintéticas, no se produciría ninguna toxina. Si el gen que se va a silenciar se encuentra dentro del propio organismo que expresa el ARN si, la tecnología se denomina tecnología del ARNi. Esta ha demostrado ser una técnica útil para estudiar la función de los genes en diversos organismos. Si la molécula de ARNic se expresa en un organismo, la célula huésped por ejemplo, y en este caso una planta de maíz, pero el gen objeto de la supresión se encuentra dentro de un patógeno contaminante, la supresión del ARNi trasciende las fronteras de las especies y se denomina silenciamiento génico inducido por el huésped (HIGS).
Un gen específico dirigido
En las investigaciones, el HIGS se utilizó para silenciar la producción de aflatoxina en los granos de maíz contaminados con Aspergillus mediante la expresión de un casete de ARNi que apuntaría a un gen biosintético en la vía de la aflatoxina fúngica. El gen elegido como objetivo para la supresión mediante la tecnología del ARNi era el gen de la poliquetosintasa de Aspergillus (denominado aflC). Se eligió este gen como objetivo porque codifica para una proteína que es necesaria para producir un precursor bioquímico de los cuatro compuestos de aflatoxina, de modo que la supresión de este paso enzimático no debería dar lugar a la producción de toxinas. Además, el gen codificador de la poliquetosintasa es de gran tamaño, por lo que al seleccionarlo como objetivo para la supresión aumentó la probabilidad de utilizar regiones del gen en el casete de ARNi que fueran específicas del gen del Aspergillus pero que no presentaran una homología significativa con ninguno de los genes expresados en el organismo huésped del maíz, ni con ninguno de los probables consumidores posteriores, como los seres humanos, los cerdos y el ganado vacuno. Concretamente, se eligieron tres regiones, cada una de ellas con una longitud aproximada de 200 pb, de la poliquetosintasa del Aspergillus para construir un casete de supresión de ARNi que se expresara en la porción comestible de los granos de maíz.
Un análisis bioinformático de las tres regiones elegidas del gen Aspergillus aflC no mostró homología en los genomas del maíz, humano, porcino o bovino. Se eligieron tres regiones del gen seleccionado para que el gen quedara completamente suprimido, en lugar de estar simplemente truncado y de que la enzima codificadora tuviera alguna actividad, y para reducir la probabilidad de que el Aspergillus contaminante pudiera desarrollar fácilmente resistencia, ya que el aumento de la resistencia consistiría en la mutación de las tres zonas seleccionadas dentro del gen alfC simultáneamente en el patógeno. Se produjeron plantas de maíz transgénico y, mediante análisis moleculares, se demostró que expresaban tanto el gen marcador seleccionable de resistencia al herbicida Bar y el casete del gen RNAiaflC insertado. Los eventos de maíz transgénico que expresaban mayor cantidad de ARNiaflC se autopolinizaron hasta que se lograron plantas que se reproducían fielmente para el casete de ARNiaflC introducido. Los granos de estas plantas que expresaban el maíz transgénico se inoculaban mientras se desarrollaban en la mazorca a los 10 días de la polinización con una cantidad conocida e igual de una cepa de hongo Aspergillus productor de aflatoxinas. Se permitió que las infecciones continuaran durante 30 días a lo largo del desarrollo de los granos. Al final del punto de infección, se cosecharon los granos que rodeaban cada sitio de infección y se combinaron de cada planta para determinar la carga de toxinas. Cada mazorca fue infectada 3-4 veces y cada sitio de infección contenía de 6-8 granos. La toxina se detectó en todos los granos de maíz no transgénicos de control con valores que oscilaban entre 1.000 y 220.000 ppb, mientras que no se detectó toxina en ninguno de los granos transgénicos (Figura 1).
Figura 1 – Ensayo de desafío de la infección por Aspergillus productor de aflatoxinas en mazorcas de maíz transgénico con supresión de ARNi.
A continuación se realizó una reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa de transcripción inversa con ARN extraído de tejido de maíz contaminado y se demostró que el gen de la poliquitectisas sintasa dirigida (aflC) no se expresaba en ninguno de los tejidos fúngicos que interactuaban con los granos transgénicos, sino que se expresaba en los granos de control no transgénicos, mientras que otro gen fúngico utilizado como control de expresión, la quitina sintasa, se expresaba a niveles comparables tanto en los granos contaminados transgénicos como en los no transgénicos. En conjunto, estas conclusiones indican que el HIGS puede utilizarse para aliviar la contaminación por aflatoxinas en los granos de maíz en desarrollo y, como tal, puede contribuir a los esfuerzos por eliminar esta toxina de los alimentos/piensos a nivel mundial.
Explorando la supresión de genes no intencional
Las tecnologías de ARNi y HIGS dependen en gran medida de la especificidad de la secuencia objetivo para suprimir el gen que se desea silenciar. Una posible desventaja de esta tecnología es que la molécula de ARNic introducida podría tener homología de secuencia con otros genes en lugar de sólo con el gen objetivo deseado y, en el caso de HIGS, tal vez compartir suficiente secuencia de forma similar a los genes en los organismos que interactúan para causar una supresión genética no deseada. Tales eventos de supresión genética no deseada se denominan a menudo «fenotipos no deseados» o «fuera del objetivo» en la comunidad biotecnológica. Como esta investigación implicaba la expresión de una molécula de ARNic en los granos de maíz, se investigó si se habían suprimido involuntariamente algunas transcripciones endógenas de ARN del maíz como resultado del casete de ARNiaflC introducido. El ARN total se extrajo de dos plantas de control no transgénicas y tres RNAiaflC que expresaban eventos transgénicos. Mediante una novedosa comparación por pares, se compararon todas las muestras de transcripción de ARN entre sí, prestando especial atención a las seis comparaciones que implicaban un evento transgénico con una muestra de control no transgénico. Aunque cada comparación por pares de una muestra transgénica/no transgénica arrojó entre 70 y 100 diferencias significativas de transcripción, cuando se analizaron las seis comparaciones transgénicas/no transgénicas no se observó ninguna transcripción individual que fuera sistemáticamente significativamente diferente en las muestras transgénicas en comparación con los controles no transgénicos. Esto indica que cuando se comparan dos muestras (transgénicas/no transgénicas) habrá pequeñas diferencias de transcripción ya que las plantas están respondiendo a sus propios microambientes y a sus etapas de desarrollo ligeramente diferentes. Sin embargo, para determinar si el casete de ARNi introducido expresado causó diferencias en las transcripciones de los granos de maíz, un análisis de comparación de seis pares no mostró transcripciones consistentemente diferentes en los granos transgénicos. Si la expresión del casete de ARNiaflC introducido causaba alguna desviación al tener homología con los genes endógenos del maíz, entonces se
esperaba que el análisis de transcripción de ARN mostrara una expresión génica alterada sistemáticamente en las tres líneas de expresión en comparación con los dos controles no transgénicos. Esto demuestra que si la secuencia utilizada para construir un casete de supresión de ARNi es específica para el gen deseado que se desea suprimir, no debería producirse ninguna desviación o fenotipo no deseado. Al demostrar que no hay diferencias significativas de transcripción en los núcleos transgénicos del ARNiaflC con respecto a los controles, éste es el primer paso para mostrar una equivalencia sustancial, en esencia una demostración de que el evento biotecnológico refleja la contrapartida no transgénica en todos los aspectos excepto en el rasgo introducido, que es un mandato regulador cuando se mueve un rasgo biotecnológico hacia la comercialización.
Esta investigación ha demostrado que HIGS es una tecnología prometedora y emocionante de utilizar para el alivio de la aflatoxina en el maíz durante la pre-cosecha, que puede extenderse a otros cultivos susceptibles a la aflatoxina y utilizarse para suprimir las micotoxinas producidas por otros hongos contaminantes. La supresión de una vía biosintética de micotoxinas por parte de HIGS es una herramienta poderosa que se puede utilizar para mejorar la salud humana, así como para contribuir sustancialmente a la seguridad alimentaria mundial y a la sostenibilidad.
